Plásmido CRISPR de Activación (h) TRAP220: sc-400855-ACT

MED1 (TRAP220) es una subunidad central del complejo Mediator que conecta factores de transcripción específicos de secuencia con la ARN polimerasa II, coordinando el inicio de la transcripción y la transcripción dependiente de potenciadores (enhancers). Como coactivador de receptores nucleares, TRAP220 integra señales de vías hormonales y metabólicas para regular programas que controlan la proliferación, la diferenciación y las respuestas celulares al estrés. El control transcripcional dependiente de MED1 se cruza con la remodelación de la cromatina y la regulación epigenética, influyendo en la especificación de linaje y en estados transcripcionales oncogénicos dependientes del contexto. La actividad desregulada de MED1 y las alteraciones en la señalización de Mediator se han asociado con cánceres sensibles a hormonas y otros trastornos que implican desequilibrios transcripcionales y metabólicos, lo que lo convierte en una diana útil para estudios mecanísticos de la regulación transcripcional.

TRAP220 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MED1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TRAP220 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MED1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MED1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TRAP220. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MED1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TRAP220 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TRAP220 en células tumorales con expresión de MED1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.