Plasmide CRISPR d'Activation (h) TRAIL: sc-418124-ACT

Le gène humain **TNFSF10** code **TRAIL** (TNF-related apoptosis-inducing ligand), une protéine membranaire de type II pouvant être libérée sous forme de cytokine soluble et se lier à des récepteurs de mort afin d’initier l’apoptose extrinsèque. La signalisation de TRAIL active la caspase-8 ainsi que les caspases effectrices en aval, tout en interagissant avec les voies NF-κB, JNK et les voies d’amplification mitochondriale pour orienter les décisions de destinée cellulaire. L’activité de TNFSF10/TRAIL influence la surveillance immunitaire, les interactions croisées inflammatoires et la régulation de l’homéostasie tissulaire, et sa dérégulation est associée à une sensibilité altérée à l’apoptose et à des interactions tumeur–système immunitaire. En tant que nœud de voie, TRAIL est fréquemment étudié dans le contexte des programmes de mort des cellules cancéreuses, des mécanismes de résistance et de la cytotoxicité médiée par le système immunitaire.

TRAIL Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNFSF10 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TRAIL Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNFSF10 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNFSF10, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TRAIL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNFSF10 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TRAIL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TRAIL dans les cellules tumorales présentant une expression de TNFSF10 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.