Plasmide CRISPR d'Activation (h) TPR: sc-402928-ACT

Le gène humain TPR code une grande nucléoporine à domaines en hélice enroulée (coiled-coil) qui constitue un échafaudage essentiel du panier du pore nucléaire, soutenant le transport nucléocytoplasmique et l’organisation nucléaire à haut niveau. TPR contribue à l’export et à la surveillance des ARNm, interagit avec le point de contrôle du fuseau lors de la mitose et aide à maintenir la stabilité du génome en coordonnant des processus associés à l’enveloppe nucléaire. Par ces fonctions, une dérégulation de TPR ou des événements de fusion impliquant TPR ont été associés à une signalisation perturbée et à des réarrangements chromosomiques observés dans plusieurs contextes cancéreux, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des programmes transcriptionnels oncogéniques et du contrôle du cycle cellulaire. La fonction de TPR est également fréquemment étudiée dans les voies qui régissent la maturation des ARN, la fidélité de la mitose et le trafic nucléaire en réponse au stress.

TPR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TPR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TPR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TPR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TPR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TPR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TPR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TPR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TPR dans les cellules tumorales présentant une expression de TPR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.