Plásmido CRISPR de Activación (h) TPPII: sc-403717-ACT

El TPP2 humano codifica la peptidasa tripeptidil II (TPPII), una gran exopeptidasa citosólica de serina que recorta los oligopéptidos generados por el sistema ubiquitina–proteasoma y contribuye al control de calidad proteica y al recambio intracelular de péptidos. Al regular el procesamiento de péptidos, la TPPII influye en la proteostasis, en la disponibilidad de péptidos antigénicos para su presentación por el MHC de clase I y en vías adaptativas al estrés vinculadas a la supervivencia celular y la apoptosis. La alteración de la actividad de TPP2/TPPII se ha asociado con proteólisis desregulada y fenotipos relacionados con el sistema inmune, lo que la hace relevante para estudios mecanísticos sobre la compensación del proteasoma, la señalización inflamatoria y las transiciones de estado celular bajo estrés proteotóxico. Por ello, TPP2 es un nodo útil para analizar cómo las peptidasas citosólicas moldean las vías de degradación de proteínas y las respuestas celulares posteriores en sistemas modelo humanos.

TPPII El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TPP2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TPPII El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TPP2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TPP2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TPPII. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TPP2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TPPII en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TPPII en células tumorales con expresión de TPP2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.