tPA CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400922-ACT

Das humane Gen **PLAT** kodiert den gewebespezifischen Plasminogenaktivator (**tPA**), eine sekretierte Serinprotease, die Plasminogen zu Plasmin umwandelt und dadurch die Fibrinolyse sowie die Proteolyse der extrazellulären Matrix reguliert. Über die Plasminbildung beeinflusst tPA das perizelluläre Remodeling, die Zellmigration und die vaskuläre Homöostase und greift dabei in Signalwege ein, die das Gleichgewicht der Gerinnung und proteaseaktivierte Signalübertragung steuern. Die PLAT-Expression ist in Endothelzellen und weiteren Zelltypen streng reguliert, und eine Fehlregulation des Plasminogenaktivierungssystems wurde mit thrombotischen und hämorrhagischen Phänotypen, neurovaskulären Schädigungen sowie dem Remodeling des Tumormikromilieus in Verbindung gebracht. Diese Eigenschaften machen PLAT zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung von Proteasenetzwerken, vaskulärer Biologie und kontextabhängiger extrazellulärer Proteolyse.

tPA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PLAT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

tPA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PLAT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PLAT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen tPA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PLAT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von tPA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des tPA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PLAT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.