Topo IIβ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400773-ACT

TOP2B kodiert die humane DNA-Topoisomerase IIβ (Topo IIβ), ein ATP-abhängiges Enzym, das DNA-Superspiralisierung und Katenierung auflöst, indem es während der Transkription und des Chromatin-Remodelings vorübergehende Doppelstrangbrüche erzeugt und die DNA anschließend wieder ligiert. Topo IIβ unterstützt die Genomorganisation und die langfristige Genregulation, trägt zu RNA-Polymerase-II-abhängigen Transkriptionsprogrammen bei und hilft, die genomische Stabilität aufrechtzuerhalten. Seine Aktivität überschneidet sich mit Signalwegen der DNA-Schadensantwort, zellzyklusgekoppelter topologischer Kontrolle und differenzierungsassoziierten Transkriptionsschaltern. Eine Fehlregulation von Funktion oder Expression von TOP2B wurde mit veränderten Transkriptionslandschaften, Phänotypen genomischer Instabilität und krankheitsrelevanten Stressantworten in Verbindung gebracht, die u. a. in der Krebsbiologie, Neurobiologie und bei Mechanismen der Kardiotoxizität untersucht werden.

Topo IIβ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TOP2B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Topo IIβ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TOP2B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TOP2B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Topo IIβ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TOP2B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Topo IIβ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Topo IIβ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TOP2B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.