Topo I Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400965-ACT

O gene humano TOP1 codifica a DNA topoisomerase I (Topo I), uma enzima nuclear que resolve o stress torsional gerado durante a replicação e a transcrição do DNA, criando quebras transitórias de cadeia simples e religando o DNA. Esta atividade apoia a sinalização da resposta a danos no DNA, a dinâmica da cromatina e a manutenção da estabilidade do genoma, associando a função de TOP1 à progressão do ciclo celular e à homeostase transcricional. A expressão ou atividade desregulada de TOP1 pode alterar a tolerância ao stress de replicação e a integridade do genoma, características frequentemente estudadas em biologia do cancro e em contextos de reparação do DNA comprometida. Processos dependentes de TOP1 também são relevantes em investigações sobre instabilidade genómica associada à transcrição e respostas celulares a venenos de topoisomerase.

Topo I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TOP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Topo I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TOP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TOP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Topo I. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TOP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Topo I no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Topo I em células tumorais com expressão de TOP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.