TMEM55B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410227-ACT

TMEM55B kodiert eine transmembrane Phosphoinositid-Phosphatase, die an der Regulation der Phosphatidylinositol-Signalübertragung beteiligt ist, indem sie die Dephosphorylierung von Phosphoinositid-Substraten katalysiert und dadurch Membranidentität und -transport beeinflusst. Durch die Modulation der Lipidzusammensetzung endosomaler und lysosomaler Membranen wird TMEM55B mit vesikulärem Transport, Rezeptorumsatz und einer übergeordneten Kontrolle der Dynamik intrazellulärer Signalprozesse in Verbindung gebracht. Eine gestörte Phosphoinositid-Homöostase ist mit dysreguliertem Zellwachstum und Stressantworten assoziiert, was TMEM55B für Studien zur Signalweg-Interaktion relevant macht, die Proliferations- und Überlebensphänotypen beeinflussen kann. In humanen Zellsystemen bieten Expression und Aktivität von TMEM55B einen nützlichen Ansatzpunkt, um lipidgetriebene Regulation der Organellenfunktion und von Signalnetzwerken in krankheitsrelevanten Kontexten zu untersuchen.

TMEM55B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TMEM55B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TMEM55B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TMEM55B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TMEM55B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TMEM55B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TMEM55B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TMEM55B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TMEM55B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TMEM55B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.