Plasmide CRISPR d'Activation (h) TMEM106C: sc-413113-ACT

TMEM106C code une protéine transmembranaire multipasse prédite, que l’on pense contribuer à l’organisation des membranes et au trafic des protéines au sein des voies sécrétoires et du système endolysosomal. En tant que membre de la famille TMEM106, TMEM106C est étudiée dans le contexte de l’homéostasie des organites, du transport vésiculaire et de la régulation du renouvellement des protéines, des processus qui recoupent les réponses au stress cellulaire et les réseaux de signalisation. Une expression altérée des régulateurs transmembranaires du trafic peut remodeler la fonction lysosomale, le flux autophagique et les signaux inflammatoires ou métaboliques en aval. Ces mécanismes font de TMEM106C une cible utile pour étudier comment la dynamique des compartiments membranaires influence les transitions d’état cellulaire et des phénotypes associés aux maladies dans des systèmes modèles humains.

TMEM106C Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TMEM106C sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TMEM106C Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TMEM106C dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TMEM106C, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TMEM106C. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TMEM106C natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TMEM106C au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TMEM106C dans les cellules tumorales présentant une expression de TMEM106C silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.