TMEM106B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404348-ACT

TMEM106B kodiert ein lysosomales Transmembranprotein, das an endolysosomalem Transport, der Größe und Ansäuerung von Lysosomen sowie der Aufrechterhaltung der zellulären Proteostase beteiligt ist. Es ist in Signal- und Regulationswege eingebunden, die die Vesikelreifung und die Autophagie-Lysosomen-Funktion steuern, und beeinflusst dadurch den Abbau von Membranproteinen und aggregierter Fracht im endosomalen System. Genetische und Expressionsstudien haben TMEM106B mit der Anfälligkeit für neurodegenerative Erkrankungen und mit Phänotypen lysosomaler Dysfunktion in Verbindung gebracht, unter anderem mit einer Modulation des Risikos für frontotemporale Demenz. Daher wird TMEM106B häufig in neuronalen und glialen Modellen untersucht, um lysosomenzentrierte Mechanismen zu erforschen, die Proteinclearance, Stressantworten und das Überleben von Zellen beeinflussen.

TMEM106B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TMEM106B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TMEM106B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TMEM106B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TMEM106B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TMEM106B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TMEM106B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TMEM106B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TMEM106B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TMEM106B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.