Plásmido CRISPR de Activación (h) Thrombospondin 3: sc-405109-ACT

THBS3 codifica trombospondina 3, una glucoproteína secretada de la matriz extracelular que modula las interacciones célula–matriz y la señalización intercelular en los tejidos conectivos. Los miembros de la familia de las trombospondinas influyen en el ensamblaje de la matriz, la fibrilogénesis del colágeno y la organización de los proteoglicanos, dando forma así a los programas de adhesión, migración y remodelación tisular. La actividad de THBS3 se estudia comúnmente en el contexto de la homeostasis de la matriz extracelular y de las respuestas al estrés que afectan el desarrollo musculoesquelético y la biología del cartílago. La señalización matricelular desregulada y la composición alterada de la MEC son características recurrentes de fenotipos degenerativos y fibróticos, lo que convierte a THBS3 en un nodo útil para estudios mecanísticos de procesos patológicos impulsados por la matriz.

Thrombospondin 3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de THBS3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Thrombospondin 3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus THBS3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional THBS3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Thrombospondin 3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo THBS3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Thrombospondin 3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Thrombospondin 3 en células tumorales con expresión de THBS3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.