Thrombin R CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400556-ACT

F2R kodiert den proteaseaktivierten Rezeptor 1 (PAR1), einen siebenfach transmembranen GPCR, der durch thrombinvermittelte Proteolyse aktiviert wird und dadurch voreingenommenes („biased“) Signaling über heterotrimere G‑Proteine initiiert. PAR1 koppelt vor allem an die Signalwege von Gαq/11, Gα12/13 und Gαi, um die Phospholipase‑C-Signalgebung, die Mobilisierung von intrazellulärem Ca2+, die RhoA‑getriebene Zytoskelett-Remodellierung, MAPK‑Kaskaden sowie Transkriptionsprogramme zu regulieren, die die Endothelbarrierefunktion, die Thrombozytenaktivierung und entzündliche Antworten beeinflussen. In vaskulären und stromalen Kontexten integriert F2R Gerinnungssignale mit Zellmigration, Adhäsion und Veränderungen der Permeabilität und ist damit relevant für Studien zu thromboseassoziierter Entzündung, Atherogenese und Signalgebung im Tumormikromilieu. Eine dysregulierte PAR1‑Signalgebung wurde in mehreren Krankheitsmodellen mit abnormer vaskulärer Reaktivität und proinflammatorischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Nutzung als mechanistisches Ziel in der Hämostase- und Gefäßbiologieforschung unterstützt.

Thrombin R Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen F2R-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Thrombin R Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des F2R-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der F2R-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Thrombin R-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native F2R-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Thrombin R-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Thrombin R-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem F2R-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.