TFPI Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423361-ACT

O gene Tfpi de camundongo codifica o inibidor da via do fator tecidual (TFPI), um inibidor de serino‑proteases do tipo Kunitz que limita o início da cascata de coagulação extrínseca ao inibir o complexo TF–FVIIa e o fator Xa. O TFPI ajuda a manter o equilíbrio hemostático vascular e modula a sinalização por proteases na superfície endotelial, conectando a coagulação a processos inflamatórios e de regulação da barreira. Alterações na expressão ou na função do TFPI estão associadas a fenótipos pró‑trombóticos e disfunção vascular, sendo frequentemente estudado no contexto de coagulopatia associada à sepse, aterosclerose e modelos de lesão endotelial. A regulação de Tfpi também se cruza com vias associadas a lipídios por meio de interações endoteliais e da ligação a lipoproteínas circulantes, tornando-o relevante para pesquisas cardiometabólicas.

TFPI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tfpi sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TFPI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tfpi em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tfpi, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TFPI. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tfpi nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TFPI no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TFPI em células tumorais com expressão de Tfpi silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.