TFII-I CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403153-ACT

GTF2I kodiert TFII-I, einen multifunktionalen Transkriptionsfaktor, der an Initiator- und E-Box-ähnliche Elemente bindet, um rezeptorproximale Signale mit RNA-Polymerase-II-abhängigen Genexpressionsprogrammen zu verknüpfen. TFII-I ist an Netzwerken der Wachstumsfaktor- und Immun-Signalübertragung beteiligt und moduliert Signalwege, die mit der MAPK/ERK-Aktivität, calciumabhängiger Transkription und stimulusresponsiver Chromatinregulation zusammenhängen. Aufgrund seiner Rolle bei der Kontrolle von Proliferation, Differenzierung und Stressantworten wurde TFII-I im Zusammenhang mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und Immun-Dysregulation untersucht, einschließlich dosissensitiver genomischer Veränderungen in 7q11.23. Eine veränderte Regulation von GTF2I bietet zudem einen mechanistischen Ansatzpunkt, um transkriptionelle Umprogrammierungen in krebsassoziierter Signalübertragung und Zellzustandsübergängen zu untersuchen.

TFII-I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GTF2I-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TFII-I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GTF2I-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GTF2I-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TFII-I-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GTF2I-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TFII-I-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TFII-I-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GTF2I-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.