TAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402586-ACT

Das humane NXF1 kodiert TAP, einen zentralen mRNA-Exportrezeptor, der Transkription und prä-mRNA-Prozessierung mit dem Transport durch die Kernpore koppelt, indem er mit NXT1 ein Heterodimer bildet und über FG-Repeat-Interaktionen an Nukleoporine bindet. TAP bindet Adapterkomplexe wie TREX und erkennt Merkmale von mRNPs, um einen effizienten nukleären Export zu fördern; dadurch beeinflusst es die globale Genexpression, die RNA-Überwachung sowie die Kopplung von Spleißen und Export. Durch seine Rolle bei der Regulierung der Zusammensetzung und der zytoplasmatischen Verfügbarkeit von mRNAs wirkt NXF1/TAP auf Signalwege wie den RNA-Stoffwechsel, die Translationskontrolle und stressresponsive Genexpressionsprogramme. Eine Fehlregulation der mRNA-Exportmaschinerie wurde mit der veränderten Homöostase des Transkriptoms in Krebs- und neurodegenerativen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, wodurch NXF1 ein relevantes Ziel für mechanistische Studien zum RNA-Transport und zur Genauigkeit der Genexpression ist.

TAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NXF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NXF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NXF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NXF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NXF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.