TAF I p63 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404427-ACT

TAF1B kodiert TAF I p63, eine zentrale Komponente des SL1-Komplexes, der für die Initiation der Transkription durch die RNA-Polymerase I an Promotoren ribosomaler DNA erforderlich ist. Durch die Unterstützung der prä-rRNA-Synthese und der Ribosomenbiogenese trägt TAF I p63 zur Funktion des Nukleolus, zur Kontrolle des Zellwachstums und zur Abstimmung der Proteostase mit dem metabolischen Bedarf bei. Die TAF1B-abhängige Regulation der rDNA-Transkription überschneidet sich mit stressresponsiven Signalwegen, die die Integrität des Nukleolus und den Verlauf des Zellzyklus modulieren. Eine veränderte Regulation der Pol-I-Transkription und der Ribosomenbiogenese wurde mit proliferativen Zuständen und ribosomopathie-assoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch TAF1B ein nützliches Ziel für mechanistische Studien zur Nukleolusbiologie und zur transkriptionellen Kontrolle darstellt.

TAF I p63 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TAF1B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TAF I p63 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TAF1B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TAF1B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TAF I p63-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TAF1B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TAF I p63-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TAF I p63-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TAF1B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.