SPTLC3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407807-ACT

SPTLC3 kodiert eine katalytische Untereinheit der Serin-Palmitoyltransferase, des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms, das die de-novo-Biosynthese von Sphingolipiden einleitet, indem es Serin mit Palmitoyl‑CoA kondensiert. Durch die Regulation der Spiegel von Sphingoidbasen, Ceramiden und nachgeschalteten komplexen Sphingolipiden beeinflusst SPTLC3 die Membranzusammensetzung, die Organisation von Lipid Rafts sowie Signalprozesse, die mit Apoptose, Entzündung und metabolischer Anpassung verknüpft sind. Die SPTLC3‑Aktivität steht in Wechselwirkung mit der Lipidhomöostase des endoplasmatischen Retikulums und mit übergeordneten Signalwegen, die den Ceramidstoffwechsel mit zellulären Stressantworten verbinden. Veränderte Sphingolipidprofile und eine dysregulierte SPTLC3‑Expression wurden mit kardiometabolischen Merkmalen und entzündlichen Phänotypen in Zusammenhang gebracht, was SPTLC3 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien zur lipidvermittelten Signalgebung macht.

SPTLC3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SPTLC3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SPTLC3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SPTLC3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SPTLC3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SPTLC3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SPTLC3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SPTLC3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SPTLC3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SPTLC3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.