Sprouty 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401299-ACT

SPRY1 kodiert Sprouty 1, einen intrazellulären Inhibitor der Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalübertragung, der als negative Rückkopplung downstream von FGF- und anderen Wachstumsfaktor-Signalen wirkt. Durch die Abschwächung der Aktivität des RAS–RAF–MEK–ERK/MAPK-Signalwegs trägt Sprouty 1 dazu bei, Zellproliferation, Migration und Differenzierung während der Entwicklung und der Gewebehomöostase zu regulieren. Eine veränderte SPRY1-Expression oder ein gestörtes Signalgleichgewicht wurde mit fehlregulierten Wachstumsfaktor-Antworten in onkogenen Kontexten sowie in Modellen der Gefäß‑, Nieren‑ und Entwicklungsbiologie in Verbindung gebracht. Als Modulator dieses Signalwegs wird Sprouty 1 häufig im Hinblick auf seine Rolle bei der Kontrolle von Signalstärke und -dauer in MAPK-abhängigen Transkriptionsprogrammen untersucht.

Sprouty 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SPRY1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Sprouty 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SPRY1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SPRY1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Sprouty 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SPRY1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Sprouty 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Sprouty 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SPRY1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.