Plásmido CRISPR de Activación (h) SPAG17: sc-410482-ACT

SPAG17 (antígeno 17 asociado a espermatozoides) codifica una proteína andamiaje asociada a microtúbulos, necesaria para una arquitectura axonemal adecuada y para el funcionamiento de los cilios móviles. Contribuye al ensamblaje y la estabilidad del complejo del par central y a las interacciones con los radios (radial spokes) que coordinan el batido impulsado por dineína, lo que vincula a SPAG17 con la organización del citoesqueleto y las vías de ciliogénesis. En la biología humana, la alteración de la expresión o la función de SPAG17 se asocia con defectos en la motilidad ciliar que pueden afectar a la biología reproductiva y a otros tejidos dependientes de cilios. Como factor regulador de cilios/flagelos, SPAG17 es un gen marcador útil para analizar programas transcripcionales que gobiernan la motilidad, la diferenciación y la dinámica de los microtúbulos.

SPAG17 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SPAG17 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SPAG17 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SPAG17 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SPAG17, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SPAG17. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SPAG17 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SPAG17 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SPAG17 en células tumorales con expresión de SPAG17 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.