Plasmide CRISPR d'Activation (h) SMRTe: sc-401150-ACT

NCOR2 code pour SMRTe (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptors), un corépresseur qui sert de plateforme d’assemblage à des complexes de répression transcriptionnelle contenant HDAC3 et d’autres facteurs apparentés de modification de la chromatine. En interagissant avec des récepteurs nucléaires et d’autres facteurs de transcription, SMRTe contribue à coordonner la compaction de la chromatine et le silençage génique dépendant du contexte au sein de programmes géniques sensibles aux hormones et impliqués dans le développement. Cette régulation croise des voies qui gouvernent les décisions de destinée cellulaire, l’homéostasie métabolique et la signalisation inflammatoire, via des effets étendus sur l’acétylation des enhancers et des promoteurs. Une activité dérégulée de NCOR2/SMRTe a été impliquée dans des réseaux transcriptionnels altérés observés en oncologie, dans des phénotypes liés au système endocrinien et dans des mécanismes de maladies à médiation immunitaire, ce qui en fait un nœud mécanistique pertinent pour les études de régulation génique.

SMRTe Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NCOR2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SMRTe Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NCOR2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NCOR2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SMRTe. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NCOR2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SMRTe au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SMRTe dans les cellules tumorales présentant une expression de NCOR2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.