Smad6 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421529-ACT

Smad6 kodiert ein inhibitorisches SMAD-Protein, das als negativer Feedback-Regulator der BMP- und – in bestimmten Kontexten – der TGF-β-Signalübertragung wirkt, indem es die Aktivierung rezeptorregulierter SMADs sowie nachgeschaltete Transkriptionsprogramme stört. In Mauszellen trägt SMAD6 dazu bei, BMP-gesteuerte Prozesse wie osteogene Differenzierung, vaskuläre Homöostase und Entwicklungsmusterbildung fein abzustimmen, indem es Signalintensität und -dauer begrenzt. Durch die Modulation der kanonischen, SMAD-abhängigen Genexpression beeinflusst SMAD6 Zellschicksalsentscheidungen, Proliferation und den Umbau der extrazellulären Matrix. Eine fehlregulierte SMAD6-Aktivität wurde in der Literatur mit einer veränderten BMP-Signalweg-Ausgabe in Verbindung gebracht, die mit kongenitalen und kardiovaskulären Phänotypen sowie Störungen der Skelettentwicklung assoziiert ist, was SMAD6 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Signalwegstudien macht.

Smad6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Smad6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Smad6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Smad6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Smad6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Smad6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Smad6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Smad6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Smad6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Smad6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.