Slfn14 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-415573-ACT

Human SLFN14 kodiert das Schlafen-Familienmitglied 14 (Slfn14), ein mutmaßliches RNA-bindendes Protein, das an der posttranskriptionellen Regulation und der Kontrolle der Proteinsynthese in hämatopoetischen Zelllinien beteiligt ist. SLFN-Proteine werden allgemein mit der Signalgebung der angeborenen Immunität und zellulären Stressantworten in Verbindung gebracht, wobei ihre Funktionen die ribosomenassoziierte Verarbeitung von RNA und die Translationseffizienz beeinflussen können. SLFN14 ist insbesondere für die Thrombozytenbiologie relevant, und eine veränderte SLFN14-Funktion wurde mit hereditärer Thrombozytopenie sowie Phänotypen einer Thrombozytenfunktionsstörung assoziiert. Diese Eigenschaften machen SLFN14 zu einem nützlichen Ansatzpunkt, um die Kontrolle der Genexpression in der Megakaryozytenreifung, der Thrombozytenproduktion und immunnahen Regulationsprogrammen zu untersuchen.

Slfn14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLFN14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Slfn14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLFN14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLFN14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Slfn14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLFN14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Slfn14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Slfn14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLFN14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.