SIRT5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416994-ACT

O SIRT5 humano codifica uma sirtuína mitocondrial dependente de NAD+ que atua principalmente como desuccinilase, demalonilase e deglutarilase de lisina, remodelando assim o panorama de acilação de enzimas metabólicas. Ao regular alvos no ciclo do TCA, na oxidação de ácidos graxos, no metabolismo de corpos cetônicos e no ciclo da ureia, o SIRT5 coordena a homeostase energética mitocondrial e o equilíbrio redox sob condições nutricionais variáveis. Alterações na atividade do SIRT5 têm sido associadas à disfunção mitocondrial, a respostas ao estresse oxidativo e à reprogramação do metabolismo intermediário observadas em diversos estados celulares relacionados a doenças, incluindo a biologia do câncer e fenótipos cardiometabólicos e ligados à neurodegeneração. Essas características tornam o SIRT5 um ponto útil para estudar o controle pós-traducional de vias mitocondriais e do metabolismo adaptativo ao estresse.

SIRT5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SIRT5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SIRT5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SIRT5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SIRT5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SIRT5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SIRT5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SIRT5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SIRT5 em células tumorais com expressão de SIRT5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.