Plasmide CRISPR d'Activation (h) Sec8: sc-405009-ACT

L’EXOC4 humain code Sec8, un composant central du complexe exocystique octamérique qui arrime les vésicules sécrétoires post-Golgi à la membrane plasmique avant la fusion membranaire dépendante des SNARE. Sec8 soutient l’exocytose polarisée, l’acheminement des protéines membranaires et la coordination du cytosquelette, reliant le trafic vésiculaire à la migration cellulaire, à l’extension des neurites et aux programmes de polarité épithéliale. Par le biais d’un trafic dépendant de l’exocyste, EXOC4 influence la signalisation et la disponibilité des récepteurs à la surface cellulaire, avec des effets en aval sur la réactivité aux facteurs de croissance et le maintien des jonctions cellule–cellule. Une dérégulation de la fonction de l’exocyste, notamment une activité EXOC4/Sec8 altérée, a été associée à des défauts de sécrétion et de polarité, fréquemment étudiés dans le contexte du comportement invasif et d’autres phénotypes cellulaires complexes pertinents pour les maladies.

Sec8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EXOC4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Sec8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EXOC4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EXOC4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Sec8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EXOC4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Sec8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Sec8 dans les cellules tumorales présentant une expression de EXOC4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.