Plasmide CRISPR d'Activation (m2) RyR-3: sc-422776-ACT-2

Chez la souris, Ryr3 code le récepteur à la ryanodine 3 (RyR‑3), un canal intracellulaire de libération de Ca2+ principalement localisé au réticulum endoplasmique/sarcoplasmique, qui médie la libération de calcium induite par le calcium et façonne les transitoires de calcium cytosolique. La signalisation Ca2+ dépendante de RyR‑3 contribue au couplage excitation–contraction, à la plasticité synaptique et à la régulation de l’expression génique dépendante de l’activité en modulant des processus tels que l’homéostasie du calcium, le couplage mitochondrial et des voies en aval liées à CaMK/CREB. Une altération de la fonction de RyR‑3 et une fuite de calcium médiée par les récepteurs à la ryanodine ont été impliquées, dans des systèmes modèles, dans des phénotypes neurodéveloppementaux et neurodégénératifs, une susceptibilité aux crises et des anomalies de la physiologie musculaire. L’édition ciblée de Ryr3 chez la souris soutient des études mécanistiques de la dynamique du calcium intracellulaire, de l’électrophysiologie et des réponses au stress du RE, permettant une validation fonctionnelle dans des modèles cellulaires neuronaux et musculaires ainsi que dans des circuits génétiques in vivo.

RyR-3 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ryr3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RyR-3 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ryr3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ryr3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RyR-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ryr3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RyR-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RyR-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ryr3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.