Plasmide CRISPR d'Activation (h) RPA 32 kDa subunit: sc-401249-ACT

RPA2 code la sous-unité de 32 kDa de la protéine A de réplication (RPA), un complexe hétérotrimérique essentiel se liant à l’ADN simple brin, qui stabilise les intermédiaires d’ADN simple brin (ssDNA) au cours de la réplication, de la recombinaison et de la réparation de l’ADN. En coordonnant l’activation des points de contrôle et le recrutement de nucléases, d’hélicases et de polymérases de réparation, RPA2 soutient la signalisation du stress de réplication dépendante d’ATR et préserve l’intégrité des fourches de réplication pendant la phase S. La fonction de RPA2 est étroitement liée aux voies de maintenance du génome, notamment la réparation par excision de nucléotides, la recombinaison homologue et les réseaux de réponse aux dommages de l’ADN qui limitent la charge mutationnelle. Une dérégulation de l’activité du complexe RPA et de la tolérance au stress de réplication a été associée à des phénotypes d’instabilité génomique pertinents pour la biologie des cancers et d’autres troubles de la réparation de l’ADN.

RPA 32 kDa subunit Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RPA2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RPA 32 kDa subunit Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RPA2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RPA2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RPA 32 kDa subunit. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RPA2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RPA 32 kDa subunit au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RPA 32 kDa subunit dans les cellules tumorales présentant une expression de RPA2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.