Plásmido CRISPR de Activación (h) RNF43: sc-403797-ACT

RNF43 codifica una ligasa E3 de ubiquitina tipo RING que actúa como regulador negativo de la señalización Wnt/β-catenina al promover la ubiquitinación y el recambio de los receptores Frizzled, limitando así la abundancia de receptores Wnt en la membrana plasmática. A través de esta función, RNF43 ayuda a controlar la homeostasis epitelial, la señalización de células madre y los programas de proliferación sensibles a la intensidad de la vía Wnt. Las alteraciones en la actividad de RNF43 se han vinculado con una señalización Wnt desregulada y con contextos genómicos asociados a la biología tumoral gastrointestinal y pancreática, lo que lo hace relevante para estudios de dependencia de la vía y retroalimentación de la señalización. RNF43 también se utiliza como un punto de entrada molecular para investigar la regulación del tráfico de receptores mediada por ubiquitina y el “cross-talk” entre vías.

RNF43 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RNF43 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RNF43 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RNF43 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RNF43, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RNF43. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RNF43 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RNF43 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RNF43 en células tumorales con expresión de RNF43 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.