Plasmide CRISPR d'Activation (h) RNase L: sc-403412-ACT

Le gène humain **RNASEL** code la RNase L, une endoribonucléase inductible par les interférons, activée par des oligoadénylates 2′-5′ produits par les protéines OAS lors de la détection innée. Une fois activée, la RNase L clive les ARN cellulaires et viraux afin de limiter la réplication, de remodeler le transcriptome et d’amplifier la signalisation antivirale via des produits de dégradation de l’ARN qui stimulent les voies de reconnaissance des motifs. Cette activité recoupe les programmes interféron/JAK-STAT, la biologie des granules de stress, le contrôle de la traduction et l’apoptose, reliant ainsi la RNase L à la régulation de l’inflammation et aux décisions de destin cellulaire. Des altérations génétiques et fonctionnelles de **RNASEL** ont été étudiées dans le contexte de la biologie des infections et des mécanismes de maladies associées à l’immunité, ainsi que de phénotypes liés aux tumeurs en rapport avec une homéostasie de l’ARN dérégulée.

RNase L Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RNASEL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RNase L Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RNASEL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RNASEL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RNase L. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RNASEL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RNase L au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RNase L dans les cellules tumorales présentant une expression de RNASEL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.