Plasmide CRISPR d'Activation (h) RNase III Drosha: sc-401639-ACT

DROSHA code l’endonucléase RNase III Drosha, un composant central du complexe nucléaire Microprocessor qui initie la biogenèse canonique des microARN en clivant les transcrits de miARN primaires en miARN précurseurs. En coopération avec DGCR8 et le traitement en aval par DICER, Drosha régule des programmes de silençage génique post‑transcriptionnel qui façonnent le contrôle du cycle cellulaire, la différenciation, les réponses au stress et la signalisation innée. Une perturbation du traitement des miARN dépendant de DROSHA a été associée à une dérégulation étendue du transcriptome ainsi qu’à des altérations des voies de réponse aux dommages de l’ADN et de l’apoptose. Une activité ou une expression aberrante de Drosha est associée à des phénotypes moléculaires observés dans de multiples contextes de cancers et de troubles du développement, ce qui étaye son utilisation comme nœud mécanistique pour l’étude des réseaux d’ARN non codants.

RNase III Drosha Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DROSHA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RNase III Drosha Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DROSHA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DROSHA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RNase III Drosha. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DROSHA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RNase III Drosha au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RNase III Drosha dans les cellules tumorales présentant une expression de DROSHA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.