Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rho T1: sc-401601-ACT

RHOT1 code pour Rho T1 (Miro1), une GTPase atypique de la famille Rho, ancrée à la membrane externe mitochondriale, qui coordonne le trafic, le positionnement et le contrôle qualité des mitochondries. Grâce à des domaines EF-hand liant le Ca2+ et à des interactions avec des adaptateurs de la kinésine et de la dynéine, RHOT1 contribue à coupler les mitochondries au transport dépendant des microtubules et régule la dynamique mitochondriale, l’homéostasie bioénergétique et la mitophagie, y compris les voies associées à PINK1/PRKN. Un dysfonctionnement de RHOT1 a été associé à une distribution mitochondriale altérée et à une dégradation/renouvellement déficients des organites, des processus impliqués dans la neurodégénérescence, les neuropathies et d’autres troubles présentant des phénotypes de stress mitochondrial. En tant que régulateur du transport mitochondrial, RHOT1 est fréquemment étudié dans des modèles neuronaux, des paradigmes de stress oxydant et des tests d’intégrité du réseau mitochondrial et de respiration.

Rho T1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RHOT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rho T1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RHOT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RHOT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rho T1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RHOT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rho T1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rho T1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RHOT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.