Retinal RX CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403576-ACT

RAX (retinal homeobox) kodiert den Transkriptionsfaktor Retinal RX, einen Homeodomänen‑Regulator vom paired-type, der für die frühe Festlegung des Augenfeldes und die Aufrechterhaltung retinaler Vorläuferzellen essenziell ist. Er wirkt stromaufwärts von Programmen der Photorezeptor- und neuroretinalen Differenzierung, indem er entwicklungsrelevante genregulatorische Netzwerke koordiniert und während der Musterbildung des Neuroektoderms Zellschicksalsentscheidungen beeinflusst. Die RAX‑Aktivität ist mit Signalwegen verknüpft, die Proliferation und Differenzierung in der sich entwickelnden Retina steuern, einschließlich Signaleingängen, die die okulare Morphogenese weiter ausformen. Eine fehlregulierte RAX‑Expression oder -Funktion wird mit angeborenen Augenfehlbildungen wie Anophthalmie/Mikrophthalmie sowie umfassenderen Störungen der retinalen Entwicklung in Verbindung gebracht, was seine Bedeutung für Krankheitsmodelle und die entwicklungsbiologische Forschung unterstreicht.

Retinal RX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAX-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Retinal RX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAX-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAX-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Retinal RX-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAX-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Retinal RX-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Retinal RX-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAX-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.