Reg IIIγ CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422640-ACT

Reg3g kodiert das regenerationsassoziierte Inselzell‑Protein 3 Gamma (Reg IIIγ), ein sekretiertes C‑Typ‑Lektin, das besonders in intestinalen Epithelzellen und Paneth‑Zell‑Kompartimenten angereichert ist und zur Abwehr an der Schleimhautbarriere beiträgt, indem es bakterielles Peptidoglykan bindet und die Interaktionen zwischen Wirt und Mikrobiota mitprägt. Seine Expression wird stark durch Zytokin‑ und mikrobielle Erkennungswege induziert, darunter IL‑22/STAT3‑Signalgebung und Toll‑like‑Rezeptor‑abhängige angeborene Immunantworten, wodurch Reg IIIγ mit epithelialer Restitution und antimikrobiellen Programmen verknüpft ist. Eine veränderte Aktivität der REG3‑Familie wurde mit entzündlichen Zuständen an Barriereoberflächen in Verbindung gebracht, weshalb Reg3g ein nützlicher Marker und mechanistischer Knotenpunkt für die Untersuchung von Darmentzündung, Dysbiose und epithelialen Stressantworten in Mausmodellen ist.

Reg IIIγ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Reg3g-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Reg IIIγ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Reg3g-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Reg3g-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Reg IIIγ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Reg3g-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Reg IIIγ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Reg IIIγ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Reg3g-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.