REDD-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401797-ACT

Das humane Gen **DDIT4** kodiert **REDD-1**, einen stressinduzierbaren Regulator, der Signale aus Hypoxie, DNA-Schädigung, ER-Stress und Nährstoffmangel integriert, um die Aktivität von **mTORC1** durch eine vorgeschaltete Modulation der **TSC1/2–Rheb-Achse** zu dämpfen. Durch die Abschwächung anaboler Wachstumsprogramme beeinflusst REDD-1 die Proteinsynthese, Autophagie, den mitochondrialen Stoffwechsel und die Redox-Homöostase und prägt so die zelluläre Anpassung an wechselnde Mikroumgebungen. Eine veränderte DDIT4/REDD-1-Expression wurde in unterschiedlichen Kontexten beschrieben, die durch metabolischen Stress und eine dysregulierte mTOR-Signalgebung gekennzeichnet sind, darunter Krebsbiologie, Neurodegeneration und entzündliche Zustände, wo sie das Überleben und die Stresstoleranz beeinflussen kann. Als transkriptionell responsiver Knotenpunkt wird REDD-1 häufig genutzt, um die Kopplung von Signalwegen zwischen HIF-1-Signalgebung, AMPK-abhängiger Energiesensorik und mTOR-gesteuerten Wachstumsoutputs zu untersuchen.

REDD-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DDIT4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

REDD-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DDIT4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DDIT4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen REDD-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DDIT4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von REDD-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des REDD-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DDIT4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.