Rbx1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402733-ACT

RBX1 kodiert Rbx1, eine RING-Box-Untereinheit der Cullin‑RING‑E3‑Ubiquitin-Ligasen (CRLs), die den Ubiquitin-Transfer katalysieren und so den proteasomalen Abbau zentraler zellulärer Proteine regulieren. Über CRL1/SCF und verwandte Komplexe beeinflusst Rbx1 den Zellzyklusfortschritt, DNA-Replikationsstressantworten und die Signaltransduktion, indem es den Umsatz von Cyclinen, CDK-Inhibitoren und Signalweg-Regulatoren steuert. Die RBX1-abhängige Ubiquitinierung ist mit der Neddylierung der Culline verknüpft und koppelt die CRL-Aktivierung an Proteostase und Checkpoint-Kontrolle. Eine dysregulierte RBX1/CRL-Aktivität steht mit veränderter Proliferation und Genomstabilität in Zusammenhang, wodurch RBX1 einen relevanten Knotenpunkt für die Untersuchung onkogener Signalwege, Stressanpassung und Verwundbarkeiten des Ubiquitin-Systems in menschlichen Zellen darstellt.

Rbx1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RBX1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rbx1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RBX1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RBX1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rbx1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RBX1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rbx1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rbx1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RBX1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.