Plásmido CRISPR de Activación (h) RBCK1: sc-402044-ACT

RBCK1 (también conocido como HOIL-1) codifica una ligasa E3 de ubiquitina que actúa como componente esencial del complejo LUBAC, catalizando la ubiquitinación unida a Met1 (lineal) para regular la señalización de NF-κB y MAPK. Mediante el ensamblaje de cadenas lineales de ubiquitina sobre intermediarios clave de señalización, RBCK1 ayuda a coordinar las respuestas inmunes innatas, la señalización inflamatoria y las decisiones de supervivencia celular aguas abajo de receptores como TNFR y los receptores de reconocimiento de patrones. RBCK1 también contribuye a las vías de control de calidad proteica y a la regulación dependiente de ubiquitina de procesos relacionados con la autofagia. La alteración o desregulación de la actividad de RBCK1 se ha asociado con fenotipos de inmunodeficiencia y autoinflamación, así como con manifestaciones miopáticas y cardiomiopáticas, lo que la hace relevante para estudios mecanísticos de la homeostasis inmunitaria y las respuestas al estrés.

RBCK1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RBCK1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RBCK1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RBCK1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RBCK1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RBCK1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RBCK1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RBCK1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RBCK1 en células tumorales con expresión de RBCK1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.