Rap 1A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400572-ACT

RAP1A codifica a Rap 1A, uma pequena GTPase da família Ras que alterna entre os estados ligados a GDP e a GTP para coordenar a transdução de sinais na membrana plasmática e em endomembranas. A Rap 1A ativa regula a sinalização “inside-out” de integrinas, a adesão célula–célula e célula–matriz e a remodelação do citoesqueleto de actina, influenciando migração, polaridade e função de barreira. Por meio de efetores como as quinases RAF, RIAM e RalGDS, a Rap 1A se cruza com a sinalização MAPK e com vias que controlam o tráfego vesicular e a dinâmica de junções. A atividade desregulada de RAP1A tem sido associada a contextos de sinalização oncogênica e a alterações no comportamento invasivo, sustentando seu uso como um nó mecanístico em estudos de progressão tumoral, biologia vascular e tráfego de células imunes.

Rap 1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAP1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rap 1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAP1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAP1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rap 1A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAP1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rap 1A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rap 1A em células tumorais com expressão de RAP1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.