Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rap 1A: sc-400572-ACT

RAP1A code Rap 1A, une petite GTPase de la famille Ras qui alterne entre des états liés au GDP et au GTP afin de coordonner la transduction des signaux à la membrane plasmique et au niveau des endomembranes. Rap 1A активée régule la signalisation « inside-out » des intégrines, l’adhérence cellule–cellule et cellule–matrice, ainsi que le remodelage du cytosquelette d’actine, influençant la migration, la polarité et la fonction de barrière. Via des effecteurs tels que les kinases RAF, RIAM et RalGDS, Rap 1A s’articule avec la signalisation MAPK et avec des voies contrôlant le trafic vésiculaire et la dynamique des jonctions. Une activité dérégulée de RAP1A a été associée à des contextes de signalisation oncogénique et à des modifications du comportement invasif, ce qui en fait un nœud mécanistique pertinent pour l’étude de la progression tumorale, de la biologie vasculaire et du trafic des cellules immunitaires.

Rap 1A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAP1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rap 1A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAP1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAP1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rap 1A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAP1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rap 1A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rap 1A dans les cellules tumorales présentant une expression de RAP1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.