Plasmide CRISPR d'Activation (h) RANK: sc-400559-ACT

TNFRSF11A code pour RANK, un membre de la superfamille des récepteurs du TNF qui constitue un nœud de signalisation central dans le contrôle, dépendant de RANKL, de la différenciation, de l’activation et de la survie des ostéoclastes. Après liaison du ligand, RANK recrute des protéines adaptatrices telles que les TRAF afin d’initier les voies de signalisation NF-κB canonique et non canonique, les cascades MAPK et des programmes transcriptionnels dépendants d’AP-1/NFATc1. Ces voies intègrent des signaux issus du microenvironnement osseux et du système immunitaire, reliant l’activité de RANK à l’ostéo-immunologie et à la régulation de l’expression de gènes inflammatoires. Une signalisation RANK dérégulée a été associée à des phénotypes anormaux de remodelage osseux et à une altération de la fonction des cellules immunitaires, faisant de TNFRSF11A une cible largement utilisée pour des études mécanistiques en biologie squelettique et inflammatoire.

RANK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNFRSF11A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RANK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNFRSF11A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNFRSF11A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RANK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNFRSF11A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RANK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RANK dans les cellules tumorales présentant une expression de TNFRSF11A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.