Raf-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400202-ACT

RAF1 codifica a Raf-1, uma quinase de serina/treonina que atua como um relé central entre o RAS ativado e a cascata MAPK, propagando sinais por meio de MEK e ERK para regular a proliferação, a diferenciação e a transcrição responsiva ao estresse. A atividade da Raf-1 é controlada por fosforilação, ligação a 14-3-3 e localização subcelular, integrando estímulos de receptores tirosina-quinase e outras entradas a montante. Para além da sinalização MAPK canônica, a Raf-1 modula a apoptose e a dinâmica do citoesqueleto por meio de funções dependentes de quinase e de scaffold que influenciam programas de sobrevivência celular. A sinalização desregulada de RAF1 e variantes de RAF1 estão associadas a controle aberrante do crescimento e a distúrbios do desenvolvimento, o que a torna um ponto frequentemente investigado no mapeamento de vias e na modelagem mecanística de doenças.

Raf-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAF1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Raf-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAF1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAF1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Raf-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAF1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Raf-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Raf-1 em células tumorais com expressão de RAF1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.