Rab 7L1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403366-ACT

RAB29 kodiert die kleine GTPase Rab 7L1, einen Golgi-assoziierten Regulator des Membrantransports, der Vesikelabschnürung, Sortierung von Frachtproteinen sowie die Dynamik des endosomalen–lysosomalen Transports koordiniert. Rab 7L1 ist an Signalwegen beteiligt, die den retrograden Transport und die Homöostase des Golgi-Apparats steuern, und unterstützt damit die korrekte Lokalisierung und den Abbau von Proteinen innerhalb sekretorischer und degradativer Systeme. In menschlichen Zellen wurde RAB29 mit stressresponsiven Transportprogrammen und funktionellen Interaktionen mit Komponenten der Autophagie–Lysosom-Achse in Verbindung gebracht – Prozesse, die häufig in der Forschung zu Neurodegeneration und inflammatorischer Signalübertragung untersucht werden. Eine veränderte RAB29-/Rab-7L1-Aktivität wurde im Kontext Parkinson-assoziierter Netzwerke untersucht, einschließlich der Modulation von LRRK2-bezogenen Transportphänotypen, was es für mechanistische Studien zur Qualitätskontrolle von Organellen relevant macht.

Rab 7L1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB29-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 7L1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB29-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB29-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 7L1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB29-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 7L1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 7L1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB29-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.