Rab 7L1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403366-ACT

RAB29 codifica la piccola GTPasi Rab 7L1, un regolatore del traffico di membrana associato al Golgi che coordina la gemmazione delle vescicole, lo smistamento del carico e la dinamica del trasporto endosoma–lisosoma. Rab 7L1 partecipa a vie che governano il traffico retrogrado e l’omeostasi del Golgi, sostenendo la corretta localizzazione e il turnover delle proteine all’interno dei sistemi secretorio e degradativo. Nelle cellule umane, RAB29 è stato associato a programmi di traffico responsivi allo stress e a interazioni funzionali con componenti dell’asse autofagia–lisosoma, processi spesso studiati nella ricerca sulla neurodegenerazione e sulla segnalazione infiammatoria. Un’attività alterata di RAB29/Rab 7L1 è stata esaminata nel contesto di reti associate al morbo di Parkinson, inclusa la modulazione di fenotipi di traffico legati a LRRK2, rendendolo rilevante per studi meccanicistici sul controllo di qualità degli organelli.

Rab 7L1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB29 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 7L1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB29 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB29, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 7L1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB29 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 7L1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 7L1 nelle cellule tumorali con espressione di RAB29 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.