Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 3B: sc-403407-ACT

RAB3B code Rab 3B, une petite GTPase enrichie dans les neurones et les tissus endocriniens, qui régule le trafic vésiculaire dépendant du Ca2+ et l’exocytose couplée à un stimulus. En tant qu’interrupteur moléculaire alternant entre des états liés au GDP et au GTP, Rab 3B coordonne l’amarrage et la maturation des vésicules via des interactions avec des effecteurs de Rab, contribuant à la dynamique des vésicules synaptiques et aux voies de sécrétion régulée. Les altérations des réseaux de transport vésiculaire associées à RAB3B sont pertinentes pour l’étude de la signalisation neuroendocrine et des phénotypes cellulaires dépendant de la sécrétion, et une dérégulation des circuits de GTPases Rab a été explorée dans des contextes neurologiques et liés au cancer. Ce gène est donc couramment utilisé pour sonder les points de contrôle du trafic membranaire qui façonnent la sécrétion, la neurotransmission et la fidélité du transport intracellulaire.

Rab 3B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB3B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 3B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB3B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB3B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 3B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB3B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 3B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 3B dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB3B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.