Rab 15 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-415722-ACT

RAB15 codifica a Rab15, uma pequena GTPase relacionada a Ras que regula o tráfego de membranas endossomais ao alternar entre estados ligados a GDP e a GTP e ao coordenar o brotamento, o transporte e a fusão de vesículas. A atividade da Rab15 tem sido associada à endocitose de receptores e a decisões de triagem que moldam a intensidade da sinalização e a captação de nutrientes, interagindo com processos dependentes de Rab de reciclagem endocítica e direcionamento lisossomal. Por meio do seu papel na dinâmica endossomal, a Rab15 pode influenciar vias que regulam o metabolismo celular, a homeostase de receptores de membrana e a transdução de sinais específica de compartimentos. Alterações na expressão ou na função de proteínas Rab endocíticas, incluindo a Rab15, são frequentemente investigadas em contextos como reprogramação de sinalização oncogênica, neurobiologia e regulação de células imunes, nos quais fenótipos dependentes de tráfego são proeminentes.

Rab 15 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAB15 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab 15 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAB15 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAB15, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab 15. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAB15 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab 15 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab 15 em células tumorais com expressão de RAB15 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.