Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 11B: sc-402256-ACT

RAB11B code la petite GTPase Rab11B, un régulateur clé de la dynamique des endosomes de recyclage, qui coordonne le trafic membranaire des endosomes vers la membrane plasmique ainsi qu’à travers le réseau trans-Golgi. En alternant entre les états liés au GDP et au GTP, Rab11B contribue à contrôler les événements de bourgeonnement, de transport et de fusion des vésicules qui façonnent le recyclage des récepteurs, le renouvellement des intégrines et la livraison polarisée de cargos. La signalisation de la famille Rab11 recoupe les programmes de remodelage du cytosquelette et de migration cellulaire via des interactions avec des effecteurs qui influencent l’organisation de l’actine et la composition membranaire. Un recyclage endocytique et un transport vésiculaire dérégulés, associés à l’activité de RAB11B, ont été liés à une altération de l’homéostasie des signaux et à des phénotypes pertinents pour l’invasion des cellules cancéreuses, la neurobiologie et, plus largement, des mécanismes de maladie liés au trafic intracellulaire.

Rab 11B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB11B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 11B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB11B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB11B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 11B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB11B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 11B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 11B dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB11B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.