Plasmide CRISPR d'Activation (m) PRP4 kinase: sc-422432-ACT

Le gène murin **Prpf4b** code la kinase **PRP4**, une kinase sérine/thréonine qui couple le contrôle de l’épissage des pré‑ARNm à la progression du cycle cellulaire en phosphorylant des composants du spliceosome et en modulant l’assemblage du spliceosome catalytique. L’activité de la kinase PRP4 influence des programmes de maturation de l’ARN qui façonnent les sorties transcriptionnelles, avec des effets en aval sur la stabilité du génome et les réponses au stress. Une signalisation anormale des kinases de l’épissage a été associée à une prolifération altérée et à des isoformes de transcrits aberrantes dans des voies liées au cancer, ce qui fait de **Prpf4b** un nœud utile pour étudier la régulation dépendante de l’épissage. Dans des modèles murins, la perturbation de **Prpf4b** soutient des travaux mécanistiques sur le métabolisme de l’ARN, la signalisation des points de contrôle et des vulnérabilités dépendantes du contexte dans des cellules à division rapide ou engagées dans la différenciation.

PRP4 kinase Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Prpf4b sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PRP4 kinase Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Prpf4b dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Prpf4b, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PRP4 kinase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Prpf4b natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PRP4 kinase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PRP4 kinase dans les cellules tumorales présentant une expression de Prpf4b silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.