PRODH Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403063-ACT

O PRODH humano codifica a desidrogenase de prolina (oxidase de prolina), uma flavoproteína mitocondrial que catalisa a primeira etapa, limitante da velocidade, do catabolismo da prolina, convertendo prolina em Δ1-pirrolina-5-carboxilato, ligando a utilização de aminoácidos ao ciclo do TCA e ao equilíbrio redox celular. Por meio da modulação da transferência de elétrons para a cadeia respiratória, o PRODH influencia o metabolismo mitocondrial, a sinalização por espécies reativas de oxigênio e a adaptação bioenergética durante estresse por limitação de nutrientes. A atividade de PRODH interage com o ciclo prolina–P5C e com redes mais amplas do metabolismo de aminoácidos que afetam apoptose, autofagia e respostas ao estresse oxidativo. A desregulação de PRODH tem sido associada a fenótipos metabólicos e neuropsiquiátricos, e o metabolismo alterado da prolina é frequentemente investigado em estudos de metabolismo do câncer e em modelos de disfunção mitocondrial.

PRODH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRODH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PRODH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRODH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRODH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PRODH. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRODH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PRODH no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PRODH em células tumorais com expressão de PRODH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.