Prestin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401428-ACT

SLC26A5 kodiert Prestin, ein membranständiges, einem Anionentransporter ähnliches Motorprotein, das in äußeren Haarzellen der Cochlea stark angereichert ist und Änderungen des Membranpotenzials in schnelle Elektromotilität umsetzt. Diese elektromechanische Transduktion unterstützt die cochleäre Verstärkung und eine scharfe Frequenzabstimmung, indem sie die Ionenhomöostase mit spannungsabhängigem konformationsbedingtem Zyklieren an der Plasmamembran verknüpft. Die Prestin-Aktivität steht in Zusammenhang mit epithelialen Ionentransportprozessen sowie mit der spezialisierten Zytoskelett- und Membranmechanik, die für die Hörfunktion erforderlich ist. Eine veränderte Expression oder Funktion von SLC26A5 ist mit sensorineuralen Hörphänotypen assoziiert und wird als molekularer Ansatzpunkt genutzt, um die Biomechanik von Haarzellen und eine Fehlregulation der Hörbahn zu untersuchen.

Prestin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC26A5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Prestin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC26A5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC26A5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Prestin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC26A5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Prestin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Prestin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC26A5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.