PRELI CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411975-ACT

Humanes PRELID1 kodiert PRELI, ein Protein des mitochondrialen Intermembranraums, das an der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Phospholipid-Homöostase und der Integrität der inneren Membran beteiligt ist. PRELI wirkt in PRELI-ähnlichen Lipidtransferwegen, die eine cardiolipinbezogene Membranorganisation, die Effizienz der oxidativen Phosphorylierung sowie mitochondriale Dynamiken unterstützen, welche Apoptose und Stressanpassung beeinflussen. Durch die Kopplung des Lipidhandlings an die Leistungsfähigkeit der Atmungskette trägt PRELI zum zellulären Energiestoffwechsel und zur Redox-Balance bei. Veränderungen der mitochondrialen Lipidzusammensetzung und der bioenergetischen Stresssignalgebung im Zusammenhang mit einer Fehlregulation von PRELID1 sind relevant für mechanistische Studien zur mitochondrialen Dysfunktion, wie sie in der Krebsbiologie und bei neurodegenerationsassoziierten Phänotypen beobachtet wird.

PRELI Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRELID1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PRELI Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRELID1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRELID1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PRELI-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRELID1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PRELI-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PRELI-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRELID1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.