Plasmide CRISPR d'Activation (h) Pr-Set7: sc-415759-ACT

KMT5A code pour Pr-Set7 (SETD8), une méthyltransférase de la lysine contenant un domaine SET qui catalyse la monométhylation de l’histone H4 sur la Lys20 (H4K20me1), une marque de chromatine associée à la maturation des nucléosomes couplée à la réplication et à l’intégrité du génome. L’activité de Pr-Set7 coordonne la progression du cycle cellulaire, l’octroi des licences de réplication de l’ADN et les réponses aux dommages de l’ADN via la régulation de la compaction de la chromatine et le recrutement de facteurs de réparation. Une expression ou une activité dérégulée de KMT5A/Pr-Set7 a été associée à des états épigénétiques altérés, au stress réplicatif et à des phénotypes prolifératifs rapportés dans de multiples contextes cancéreux. En tant qu’enzyme de la chromatine à l’interface entre le contrôle épigénétique et la signalisation des points de contrôle, KMT5A est largement étudiée pour son rôle dans la régulation transcriptionnelle, les interactions entre voies de réparation de l’ADN et la dynamique de la chromatine.

Pr-Set7 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KMT5A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Pr-Set7 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KMT5A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KMT5A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Pr-Set7. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KMT5A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Pr-Set7 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Pr-Set7 dans les cellules tumorales présentant une expression de KMT5A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.