POT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403275-ACT

POT1 (Protection of Telomeres 1) kodiert eine zentrale Komponente des Shelterin-Komplexes, der an einzelsträngige telomerische DNA bindet und den Schutz der Telomerenden reguliert. Indem POT1 den Zugang der Telomerase steuert und eine unangemessene, ATR-abhängige DNA-Schadenssignalgebung an Chromosomenenden begrenzt, trägt es zur Aufrechterhaltung der Telomerlängenhomöostase und der Genomstabilität bei. Eine veränderte POT1-Funktion wird mit Telomer-Dysfunktion, Replikationsstress und chromosomaler Instabilität in Verbindung gebracht – Prozesse, die die zelluläre Seneszenz und die onkogene Transformation beeinflussen. Als Faktor der Telomererhaltung wird POT1 häufig in Signalwegen untersucht, die DNA-Replikation, DNA-Schadensantwort und die Verarbeitung von Chromosomenenden steuern.

POT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

POT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen POT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von POT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des POT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.