Plasmide CRISPR d'Activation (h) Pol III RPC32: sc-417072-ACT

POLR3G code la sous-unité RPC32 de la polymérase III (Pol III), un composant central de l’ARN polymérase III requis pour la transcription de petits ARN non codants, notamment les ARNt et l’ARNr 5S, qui soutiennent la biogenèse des ribosomes et la protéostasie. Par son rôle dans l’assemblage de Pol III et l’initiation dépendante du promoteur, RPC32 de Pol III contribue aux programmes de croissance cellulaire et à l’adaptation métabolique liées à la détection des nutriments et aux réponses au stress. Une régulation altérée de la production de Pol III et de ses sous-unités accessoires a été associée à une prolifération dérégulée et à des voies de signalisation de l’immunité innée, faisant de POLR3G une cible utile pour étudier le contrôle transcriptionnel des réseaux de petits ARN. L’étude de la fonction de POLR3G peut aider à clarifier comment l’activité de Pol III s’articule avec la régulation de la chromatine et l’homéostasie des ARN dans des états cellulaires pertinents pour les maladies.

Pol III RPC32 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POLR3G sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Pol III RPC32 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POLR3G dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POLR3G, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Pol III RPC32. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POLR3G natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Pol III RPC32 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Pol III RPC32 dans les cellules tumorales présentant une expression de POLR3G silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.