Plasmide CRISPR d'Activation (h) POH1: sc-405591-ACT

PSMD14 code pour POH1, une sous-unité métalloprotéase JAMM/MPN+ de la particule régulatrice 19S du protéasome humain 26S, qui retire les chaînes d’ubiquitine liées en K48 au cours du traitement des substrats. En couplant la désubiquitination à la dégradation protéasomale, POH1 contribue au maintien de l’homéostasie protéique et module le renouvellement de régulateurs clés impliqués dans les réponses aux dommages de l’ADN, la progression du cycle cellulaire et la signalisation d’adaptation au stress. L’activité de PSMD14 s’articule avec le contrôle ubiquitine‑dépendant des processus associés à la chromatine et peut influencer des voies telles que la signalisation NF‑κB via la dégradation régulée de composants de la voie. La dérégulation de la désubiquitination associée au protéasome a été reliée à des phénotypes anormaux de protéostase et de stabilité du génome, pertinents pour la biologie du cancer et la recherche sur la neurodégénérescence.

POH1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PSMD14 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

POH1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PSMD14 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PSMD14, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de POH1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PSMD14 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de POH1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie POH1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PSMD14 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.